在精准医疗浪潮中，基因治疗作为极具潜力的前沿技术，从基因层面直击疾病根源，有望实现「一次治疗，终生获益」的长期临床效果。当下，基因治疗已在罕见病、眼科疾病、神经退行性疾病以及肿瘤治疗等难治性疾病领域取得突破性进展。
腺相关病毒（AAV）载体凭借高转导效率、强组织与细胞靶向性，以及低免疫原性等显著优势，在基因治疗领域脱颖而出，成为应用最为广泛的基因递送工具。
当前，美国食品和药品监督管理局（FDA）已批准 8 款 AAV 基因疗法上市。国内基因治疗领域进展颇多。信念医药研发的针对血友病 B 的 AAV 基因疗法正处于获批上市的关键阶段，有望填补国产 AAV 基因疗法上市的空白。
今年 2 月，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来教授凭借双 AAV 基因疗法，使耳聋患者听力得到恢复，成为 34 年来首位荣获“临床科学创新奖” 的亚洲科学家。
同月，特宝生物通过收购九天生物部分资产，将多个 AAV 基因疗法研发管线纳入旗下，交易总价最高可达 5800 万美元，这一举措助力特宝生物迅速切入 AAV 基因疗法领域，加速创新基因治疗产品的开发与应用，也进一步彰显了国内 AAV 基因疗法产业的广阔前景。
近日，一名接受 Sarepta 杜氏肌营养不良症（DMD）基因疗法 Elevidys 的青少年男孩因肝功能衰竭死亡。在接受 Elevidys 临床试验和商业治疗的 800 多名患者中，这是第一例患者死亡病例。该事件在行业内引发轩然大波，引发各界对 AAV 基因疗法安全性的深刻思考，也进一步凸显出 AAV 生产环节严格把控的重要性。
事实上，AAV 病毒载体生产工艺开发面临诸多挑战。生产环节复杂，病毒载体生产与纯化过程中存在工艺放大难、纯化难度大、稳定性欠佳等问题，大规模生产仍是该领域亟待攻克的关键挑战。
质量源于设计（QbD）理念强调了前置药物的质量控制，这也意味着企业从原材料的选择上就要严格把关以符合监管要求，规避后续可能存在的风险。现从 AAV 病毒生产上游工艺中质粒、产毒株细胞和质粒转染三个方面剖析影响 AAV 生产规模化的影响因素。
01质 粒
质粒是生产 AAV 的起始原料，通常在重组大肠杆菌发酵过程中获取。质粒生产流程涵盖发酵、菌体收集、菌体裂解、固液分离、澄清、层析以及浓缩等多个环节。在质粒大规模发酵过程中，多个因素协同影响质粒产率。
在质粒大规模纯化环节，碱裂解法是裂解菌体的常用方法。在此过程中，需严格控制 pH 值、剪切力和裂解时间，防止过度裂解对质粒造成损伤。层析纯化作为大规模质粒纯化的主流技术，填料孔径的选择对质粒吸附性能影响显著。企业需根据质粒特性，选择合适的填料，以实现高效纯化。
02
产毒株细胞
理想的产毒株细胞系应具备生长速度快、培养便捷、能高效支持 AAV 病毒复制和包装的特点。此外，细胞系来源需可溯源，无外源因子污染，并且在规模化培养过程中保持传代稳定性、遗传稳定性和状态稳定性。
目前，HEK293 细胞贴壁培养技术常用于实验室小剂量病毒生产。而悬浮无血清细胞培养系统，如 HEK293、SF9 等细胞系的应用，极大地简化了 AAV 生产的工艺放大流程，同时减轻了下游纯化的负担。
为保障细胞系在规模化培养中的稳定性，需定期进行细胞鉴定，采用 STR（短串联重复序列）分型技术确保细胞身份的准确性，通过支原体检测试剂盒杜绝支原体污染。
03
质粒转染
转染效率低、质粒 DNA 和转染试剂成本高，是 AAV 载体生产面临的主要难题。
聚乙烯亚胺（PEI）是 AAV 规模化生产中应用最广泛的转染试剂，虽价格低廉，但对细胞具有一定毒性，且对环境 pH 变化较为敏感。脂质体转染效率相对较高，细胞毒性低，然而试剂费用高昂，在大规模生产中成本压力较大。磷酸钙转染虽成本较低，但试剂纯度和 pH 敏感性会导致 AAV 生产批次间差异显著。
在三质粒转染悬浮细胞培养系统中，质粒分配比例的失衡会降低转染效率，进而导致空衣壳比率出现明显的批次差异。构建衣壳基因序列及其它生产相关基因序列稳定整合的 AAV 包装细胞系统，有望解决这一问题。
在生物制药领域，实现 AAV 规模化生产，搭建稳定且易放大的生产体系是工艺开发的重点之一。在如今药物开发竞争白热化的大环境下，构建这样一套生产体系，需以耗费大量的人力成本、时间和金钱成本为代价，无疑加重企业和研发人员的负担。
为助力行业突破 AAV 规模化生产的重重难关，2025 年 4 月 17 日（周四）19：00 - 20 ：30，医麦客携手翌圣生物和行诚生物共同推出的主题为「从质粒到转染：AAV规模化生产中的关键原料技术突破与合规性实战经验分享」的直播课。
届时，翌圣生物研发总监滕以刚博士和行诚生物李军辉博士将结合切身丰富的 AAV 生产项目经历，深度剖析 AAV 规模化生产的质粒制备、转染环节的技术要点，助力大家突破技术瓶颈。欢迎大家积极报名！
